تشخیص آزمایشگاهی روغن آرگان ناخالص که با روغن های گیاهی دیگر مخلوط شده باشد.
هدف این کار کمک به کنترل صحت سنجی روغن آرگان خالص، محصول ارزشمند کشور مراکش است. در این آزمایش استیگ مستادین ۳و۵، استرهای آلکیلی اسیدهای چرب، رنگ‌دانه‌های کلروفیلی و خواص فیزیکی مانند ویسکوزیته، چگالی و ضریب شکست موردمطالعه قرار گرفته‌اند تا ناخالصی روغن آرگان که با روغن‌های گیاهی دیگر مخلوط شده مشخص شود. نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه نشان می‌دهند که ۳،۵ استیگ مستادین، کورن و فئوفیتین می‌توانند به‌عنوان نشانگرهای احتمالی جدید برای ترکیبات روغن آرگان تا ۵% تصفیه‌شده و روغن‌های زیتون خالص و آفتابگردان به کار روند. به دلیل تشابه ترکیبات اسید چرب در روغن‌های خوراکی موردمطالعه و روغن آرگان، اسیدهای چرب می‌توانند به‌عنوان نشانگرهایی برای تشخیص روغن آرگان تقلبی در سطوح بیشتر از ۱۰% استفاده شوند. در میان خواص فیزیکی موردمطالعه، ضریب شکست اختلاف قابل‌توجهی در روغن آفتابگردان و ترکیبات آن با ۱۰% روغن آرگان نشان می‌دهد.کلیدواژه‌ها: تقلبی- روغن آرگان- GC – HPLC- روغن زیتون- روغن آفتابگردان

۱. مقدمه

روغن آرگان از میوه‌های درخت آرگان (گونه‌ای درخت با نام علمی Argania spinosa) به دست می‌آید که یک گونه بومی در جنوب غربی مراکش است، جایی که نقش محیط زیستی و اقتصادی‌اجتماعی مهمی را در کشور مراکش بازی می‌کند. یونسکو در سال ۱۹۹۸ به‌منظور حفاظت از این زیست‌بوم منحصربه‌فرد، درخت آرگان را یک منبع زیست‌کره زمین اعلام کرد. این گیاه به‌خوبی با شرایط نسبتاً کم آب سازگاری دارد. بااین‌حال، در یک دوره تغییر اقلیمی و افزایش خشک‌سالی در نواحی خشک و نیمه‌ خشک، سطح توزیع آن به نواحی معتدل‌تری مانند کناره ساحل کاهش یافته است. خواص ضد باکتری و کشنده قارچ ،روغن آرگان و همچنین سایر تأثیرات مفید آن بر سلامتی به‌خوبی شناخته شده‌اند. طب سنتی مراکش از روغن آرگان خالص تهیه‌شده برای تأثیرات حفاظت کبدی، عامل کلسترول (هیپوکلسترولمیک) و ضد آترواسکلروز و همچنین در درمان بیماری‌هایی مانند روماتیسم و آسیب‌شناسی پوستی یا مفصلی استفاده می‌کنند. ترکیب شیمیایی این روغن توسط (Moukal 2004؛ Charrouf و Guillaume 2008)موردبررسی قرار گرفت و مشخص شد که منشأ جغرافیایی میوه آرگان، زمان برشته کردن (در روغن خوراکی)و روش عصاره گیری مورداستفاده برای تولید روغن آرگان تأثیر قابل‌توجهی بر مشخصات و ترکیب فیزیکی‌ شیمیایی آن دارند (Hilali و همکارانش ۲۰۰۵؛ Cayuela و همکارانش ۲۰۰۸؛ Marfil و همکارانش ۲۰۰۸، Harhar و همکارانش ۲۰۱۱؛ Guinda و همکارانش ۲۰۱۱). در سال ۲۰۰۳ برای تعریف مشخصات کیفی روغن آرگان خالص و دسته‌بندی آن در گروه‌های مختلف یک قاعده مراکشی ایجاد شد؛ روغن بسیار خالص بیشترین سطح کیفی را دارد (قاعده مراکشی ۲۰۰۳). هرسال چهار هزار تن روغن آرگان خالص در مراکش تولید می‌شود که ۲۵۰۰ تن به صادرات اختصاص داده می‌شوند. قیمت هر لیتر روغن آرگان در اروپا تقریباً ۱۰۰دلار می‌باشد و یک غذای لوکس تلقی می‌شود. به دلیل قیمت آن، همیشه این احتمال وجود دارد که شیوه‌های غیرقانونی مانند رقیق کردن با روغن‌های ارزان‌تر اتفاق بیافتد. تشخیص روغن تقلبی مشکل پیچیده‌ای است. به‌علاوه، مخلوط کردن دو روغن با ترکیب مشابه می‌تواند تشخیص را سخت تر کند ، روغن زیتون تقلبی ساخته‌شده با روغن فندق این مسئله را ثابت می‌کند (Christy و همکارانش ۲۰۰۴، Zabaras2010). در حال حاضر، مطالعاتی که روغن آرگان را از سایر روغن‌های خوراکی متمایز می‌کنند، بسیار نادر هستند. در سال‌های اخیر، Gonzalvez و همکارانش (۲۰۱۰) به‌وسیله اندازه‌گیری نشر نور پلاسمای کوپل شده به‌صورت القایی را در ترکیب با رویکردهای شیمی سنجی مختلف انجام داد. مطالعات توسط ۱۶ متغیر (Na, Mg, Al, K, Ca, Ti, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pr, Sm, Er و Bi) انجام شدند. تحلیل خوشه‌ای ترتیبی قادر به تمایز نمونه‌های روغن آفتابگردان از سایر نمونه‌ها بود، بااین‌حال تشخیص روغن آرگان از روغن‌های زیتون و سویا بر اساس ردیابی ترکیبات عنصری متفاوت آن‌ها به‌سختی حاصل شد. Rezanka و Rezankova 1999، تحلیل خوشه‌ای و مقیاس بندی چندبعدی با اندازه‌گیری مجذور کای ناهماهنگی‌ها را بهترین روش برای تعیین شباهت روغن‌ها بر اساس مقدار درصدی، اسیدهای چرب یا تری گلیسیریدها تلقی کردند. تشخیص تحلیلی امکان تقلبی بودن روغن آرگان بسیار راحت‌تر می‌شود وقتی‌که روش‌های آماری چندمتغیره استفاده می‌شوند. Hilali و همکارانش (۲۰۰۷) کمپسترول را به دلیل تعیین سطح آن در روغن آرگان به‌عنوان یک نشانگر تقلبی بودن ارائه دادند، و پیشنهاد کردند که آن می‌تواند شاخص تحلیلی اصلی برای بررسی خلوص روغن تا بیش از ۹۸% باشد. روغن‌های غنی از کمپسترول، (سویا، کلزا، بادام‌زمینی، کنجد) در سطوح تقلبی ۱% تشخیص داده شدند. نتایج مشابهی با روغن آفتابگردان به دست آمد. در روغن‌هایی با کمپسترول کم، این روش مجاز به کاربرد برچسب خلوص ۹۵% در مورد روغن زیتون و فندق و برچسب خلوص ۹۸% در روغن زردآلو است. به‌علاوه، اسید فرولیک به‌عنوان یک نشانگر ترکیب فنلی جهت کنترل صحت سنجی روغن آرگان مورد تائید قرار گرفت (Zougagh و همکارانش ۲۰۱۱). نویسندگان روش جدیدی مبتنی بر تشکیل نانو ذرات طلا و تحلیل طیف‌سنجی به‌منظور ارزیابی تقلبی بودن روغن‌های آرگان خالص توسعه دادند.
به‌منظور تشخیص تقلبی بودن روغن آرگان با روغن‌های گیاهی خوراکی، پارامترهایی شامل ۳،۵-استیگم ستادین، استرهای آلکیلی اسیدهای چرب، رنگ‌دانه‌های کلروفیلی و هیدروکربن‌ها در این مطالعه اتخاذ شدند.
چند مطالعه در مورد تشخیص روغن‌های گیاهی خوراکی توسط جزء هیدروکربنی گزارش شد. هیدروکربن‌ها کوچک‌ترین ترکیبات قطبی ماده غیرقابل صابونی‌شدن در روغن‌های گیاهی هستند.تشخیص هیدروکربن‌ها توسط رنگ‌شناسی گازی در مشخصه یابی روغن‌های گیاهی خوراکی، به‌خصوص در روغن‌های زیتون خالص و همچنین در روغن‌های زیتون ناخالص ساخته‌شده با روغن‌های ارزان‌تر به‌کاررفته است. به دلیل فرآیندهای تصفیه مقدار قابل‌توجهی از یک ترکیب استروئیدی، ۳،۵-استیگمستادین، در روغن‌های گیاهی تشکیل می‌شود. این ترکیب از آب‌زدایی سیتوسترول-β حاصل می‌شود . بسته به شرایط تصفیه، روغن‌های گیاهی تصفیه‌شده مقدار ۳،۵-استیگمستادین بین ۱ و ۲۹ mg kg–۱ دارند. بنابراین، ارزیابی استیگمستادین در روغن‌های گیاهی نه‌تنها برای تشخیص روغن‌های حرارت داده‌شده بلکه برای تشخیص روغن زیتون ناخالص ترکیب شده با روغن‌های تصفیه‌شده مجاز می باشد. استرهای آلکیلی اسیدهای چرب خانواده‌ای از لیپیدهای (نوعی چربی) خنثی طبیعی موجود در روغن زیتون هستند و با استری کردن اسیدهای چرب آزاد با الکل‌های مولکولی کم تشکیل می‌شوند. شیوه‌های نامناسب در حین فرآیند عصاره گیری روغن زیتون و یک میوه زیتون کم کیفیت شکل‌دهی آن‌ها را افزایش می‌دهد. ترکیباتی از روغن زیتون کم کیفیت تصفیه‌شده “غیرالکلی” و روغن زیتون بسیار خالص می‌تواند توسط غلظت استر آلکیلی آن‌ها تشخیص داده شوند. ترکیب استرهای آلکیلی اسید چرب در روغن آرگان قبلاً موردمطالعه قرار نگرفته است، بااین‌حال در روغن زیتون، این ترکیبات به‌طور گسترده‌ای بررسی شدند. بنابراین، تحلیل استر آلکیلی اسید چرب جهت تشخیص وجود روغن زیتون کم کیفیت در روغن آرگان موردتوجه قرار گرفت. در این راستا، رنگ‌دانه‌های کلروفیلی مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفتند تا ترکیبات روغن آرگان با روغن زیتون بسیار خالص را تشخیص دهند. این روغن به دلیل وجود رنگ‌دانه‌های کلروفیل و کاراتنوئید ترکیبی از رنگ‌های زرد و سبز دارد که در روغن‌های دانه‌ای نیستند. به‌علاوه با مطالعه ویسکوزیته در روغن‌های مدنظر را برای تشخیص احتمال تقلبی بودن روغن آرگان خالص لحاظ کردیم، چراکه این پارامتر فیزیکی مستقیماً به ترکیب تری اکسی گلیسرول، جزء اصلی روغن‌ها، وابسته است. بنابراین، این تشخیص مستقیم و اقتصادی است. درنهایت، ما سایر خواص فیزیکی مانند چگالی و ضریب شکست را مورد تجزیه‌وتحلیل قرار دادیم که مستقیماً با خلوص روغن آرگان در ارتباط هستند.

۲. مواد و روش‌ها

۲.۱ مواد
نمونه‌های روغن
شصت درصد نمونه‌های روغن آرگان در بازار مراکش خریداری می‌شوند و بقیه نمونه‌های روغن آرگان توسط کارخانه صنعتی Arganoil Company Ltd تأمین می‌شوند. روغن‌های آفتابگردان و زیتون در بازار اسپانیا خریداری می‌شوند. تمام نمونه‌ها تا زمان تحلیل در -۴۰ ℃ نگهداری می‌شوند. برای شناسایی ترکیبات روغن، جدول ۱ را ببینید. ۹۶ نمونه روغن برای انجام این مطالعه استفاده شدند.
جدول ۱. نمونه‌های روغن ترکیبی آرگان

VOO: روغن زیتون خالص؛ OO: روغن زیتون؛ HOSO: روغن آفتابگردان با الوئیک بالا؛ SO: روغن آفتابگردان.
معرف‌ها و استانداردها
تمام معرف‌ها از درجه معرف تحلیلی برخوردار بودند مگر این‌که خلافش ذکر شود. استانداردهای n-اکوسان، ۳،۵-کلستادین، متیل هپاتاداکانو و کلروفیل-a از سیگما-آلدریچ خریداری شدند (شیمیایی سیگما-آلدریچ، مادرید، اسپانیا). کارتریج SPE (6 mL)، بسته‌بندی‌شده با فاز سیلیکا ژل (۱ g)، از Varian (EA Middelburg، هلند) بود.
۲.۲ ترکیب اسید چرب
ترکیب اسید چرب نمونه‌های روغن توسط رنگ‌شناسی گازی تحت عنوان استرهای متیلی اسید چرب تعیین شد. تبادل استری تری اکسی گلیسیرید توسط یک محلول متانولی سرد از هیدروکسید پتاسیم، به گفته کمیسیون اتحادیه اروپایی در سال ۱۹۹۱، انجام شد. برای تشخیص رنگ‌شناسی استرهای متیلی اسید چرب یک رنگ‌شناس گازی HP 6890N (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) مجهز به یک استوانه مویین (Supelcowax:
۶۰ m × ۰.۲۵ mm; 0.25 mm)، تزریق کننده دوبخشی خودکار و یک آشکارساز یونش شعله‌ای (FID) استفاده شد. گاز حامل هیدروژن، با سرعت جریان mL min–۱ ۱ بود. دماهای تزریق کننده و آشکارساز به ترتیب در ۲۱۰ و ۲۵۰℃ نگه‌داشته شدند. فر در ۱۶۵℃ (۱۰ min) برنامه‌ریزی شد و با ۱,۵ °C min–۱ تا ۲۰۰ °C (10 min) افزایش یافت. حجم تزریق ۱ μL بود. ترکیب اسید چرب به‌صورت درصد نسبی هر اسید چرب بیان شد.
۲.۳ تعیین خواص فیزیکی
به‌طور مرسوم، چگالی توسط یک پیکنومتر۲۵ mL تعیین شد که قبلاً توسط آب مقطر کالیبره شده بود و اندازه‌گیری لزجت دینامیک با یک ویسکومتر (لزجت سنج) با گلوله در حال سقوط کنترل‌شده دمایی یا با یک رئومتر مجهز به صفحه مخروطی، بر اساس استانداردها، انجام شد. در این کار یک ویسکومتر Stabinger SVM 3000 (Anton Paar GmbH Graz، اتریش) برای تعین چگالی و لزجت استفاده شد. پر کردن و تمیز کردن ابزار به‌طور دستی انجام می‌شود. SVM مجهز به دستگاه تنظیم دمای سریع (بدون نیاز به حمام آب) و اندازه‌گیری داده بود، که در یک سیستم PC با رابط سری انجام شدند. حجم ۵ mL از نمونه به کار گرفته شد. هر آزمون سه بار انجام شد. برای پر کردن سلول، سرنگ‌های پلاستیکی یک‌بارمصرف استفاده شدند و هگزان-n برای تمیزکاری سلول به کار رفت. مقادیر حاصل به ترتیب برای چگالی و لزجت تنها تا رقم دوم و سوم بعد از کاما صحیح هستند. ضرایب شکست با یک شکست‌سنج Abbe کنترل‌شده دمایی (Hilger و Watts Ltd ، لندن، اوکراین)، با استفاده از نور سفید برای اندازه‌گیری (IUPAC, 1992، No. 2102) تعیین شدند. هریک از این سه پارامتر فیزیکی در ۲۰ و ۴۰℃ در تمام روغن‌های گیاهی در این مطالعه تعیین شدند.
۲.۴ جزء هیدروکربنی
کمی سنجی هیدروکربن خطی
جداسازی (ایزولاسیون) جزء هیدروکربنی توسط آب کافت (هیدرولیز) قلیایی ۲۰ g نمونه روغن با غلظت معین ۰.۲۵ mL از یک محلول استاندارد n-اکوسان (۰.۰۵ mg mL–۱) انجام شد، همان‌طور که توسط Guinda و همکارانش ۱۹۹۶ شرح داده شد. باقیمانده غیرقابل صابونی شده توسط یک استوانه کم‌فشار سیلیکا ژل (۱۵ g)با استفاده از هگزان به‌عنوان شوینده تجزیه شد. جزء جمع‌آوری‌شده با شستن ۳۵ mL تقریباً تا ۱ mL تغلیظ شد. یک قسمت ۱ μL از این جز، حاوی هیدروکربن‌های چربی‌دار اشباع و غیراشباع، با رنگ‌شناسی گازی توسط یک رنگ‌شناس گازی HP 6890N مجهز به یک استوانه مویین (SPB5: 10 m × ۰.۳۲ mm, Supelco, Bellefonte, PA)، تزریق کننده دوبخشی و آشکارساز FID مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت. گاز حامل هیدروژن با سرعت جریان ۱ mL min–۱ است. شرایط کاری به‌صورت زیر بود: دمای اولیه فر برای ۱ min 60℃ و سپس برای ۱ min در ۱۲℃ بر min–۱ برنامه‌ریزی شد، در ادامه برای ۱ min افزایش ۷ °C min–۱ تا بیش از ۳۴۰℃ داشت. دماهای تزریق کننده و آشکارساز به ترتیب ۲۸۰℃ و ۳۵۰℃ بودند.
تعیین هیدروکربن‌های استروئیدی
تعیین کمی ۳،۵-استیگمستادین در روغن‌های گیاهی رویکردهای استانداردشده توسط IUPAC را دنبال می‌کند (Dobarganes و همکارانش ۱۹۹۹). نمونه روغن(۲۰ g)، با غلظت معین ۱ mL در استاندارد داخلی (۳،۵-کلستادین؛ ۲۰ μg mL–۱)، صابونی شد و قسمت صابونی نشده در یک استوانه کم‌فشار سیلیکا ژل با استفاده از هگزان به‌عنوان شوینده تجزیه شد. ۳۵ mL اولیه از شوینده کنار گذاشته شد، قسمت۴۰ mL بعدی تا خشک شدن تبخیر شد و بقیه در ۰.۵ mL هپتان حل شد. یک قسمت ۱ μL با رنگ‌شناسی گازی توسط یک رنگ‌شناس گازی HP 6890N مجهز به یک استوانه مویین (SPB5: 10 m × ۰.۳۲ mm, Supelco, Bellefonte, PA)، تزریق کننده دوبخشی و آشکارساز FID مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت. گاز حامل هیدروژن با سرعت جریان ۱ mL min–۱ است. دماهای تزریق کننده و آشکارساز به ترتیب ۲۸۰℃ و ۳۵۰℃ بودند. فر برای ۵ min در ۲۱۰℃ برنامه‌ریزی شد و سپس با ۳ °C min–۱ تا بیش از۲۸۰℃ (۶ min) افزایش یافت.
۲.۵ کمی سنجی استر آلکیلی
استرهای اتیل و متیل مطابق با روند Perez-Camino و همکارانش (۲۰۰۲) مشخص شدند. به‌طور خلاصه،
۰.۲ g نمونه روغن در ۱ mL هگزان حل شد و با ۵۰۰ μL محلول استاندارد متیل هپتادسانات۰.۱ mg mL–۱ ترکیب شد. یک کارتریج SPE سیلیکا ۱g یک میلی‌متر از این محلول را تجزیه نمود. ترکیبی از هگزان/تولن (۸۵:۱۵; v/v) به‌عنوان شوینده به کار گرفته شد. ۷ mL اولیه کنار گذاشته شد و قسمت ۱۰ mL بعدی جمع‌آوری شد و تحت کاهش فشار تبخیر شد. بقیه در۳۰۰ μL هپتان حل شد. تشخیص رنگ‌شناسی گازی استرهای آلکیلی با استفاده از یک رنگ‌شناس گازی HP 5890 (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) مجهز به استوانه مویین سیلیکایی فیوزدار پوشش داده‌شده با سیناپروپیل سیلیکون انجام شد (SPB5 10 m × ۰.۳۲ mm, Supelco, Bellefonte, PA). هیدروژن به‌عنوان گاز حامل استفاده شد. دمای ۷۰ °C اولیه فر با ۱۵ °C min–۱ تا بیش از
۱۵۰ °C؛ سپس با ۱۲ °C min–۱ تا بیش از ۳۴۰℃ افزایش یافت و به مدت ۱۲ min در دمای نهایی نگه‌داشته شد. دمای آشکارساز ۳۵۰℃ بود. حجم تزریق ۱ μL بود.
۲.۶ تحلیل رنگ‌دانه
جداسازی رنگ‌دانه‌های فئوفیتین و پیروفئوفتین بر اساس Hornero-Mendez و همکارانش (۲۰۰۵) توسط SPE انجام شد. پس از شستن با ۱۲ mL مخلوط حلال اتر/دی اتیل اتر نفت خام ۹۰:۱۰، بخش عمده لیپیدها کنار گذاشته شد و جزء حاوی رنگ‌دانه‌ها پس از شستن با ۳ mL استون جمع‌آوری شدند. شوینده با HPLC (HP 1100؛ Hewlett- Packard, Palo Alto, CA) مجهز به یک استوانه فولادی ضدزنگ (۲۵ cm × ۰.۴۶ cm i.d.) ، بسته‌بندی‌شده با ۵ μm C18 Spherisorb ODS-2 (Teknokroma، بارسلونا، اسپانیا) تجزیه‌وتحلیل شد. یک شستشوی ایزوکراتیک (با قسمت‌های برابر اجزاء) با آب-استون-متانول (۳۶:۶۰:۴, v/v/v) استفاده شد. تشخیص ترتیبی با یک آشکارساز آرایه‌ای دیودی انجام شد. رنگ‌دانه‌ها در طول‌موج جذب حداکثر (۴۱۰ nm) با منحنی کالیبراسیون کلروفیل در محدوده غلظتی مطابق با سطوح این رنگ‌دانه در روغن زیتون خالص کیفی سازی شدند. بدین منظور در این تشخیص فرض شد که شاخص‌های پاسخ در تمام رنگ‌دانه‌ها برابر هستند.
۲.۷ تحلیل آماری داده‌های آزمایشگاهی
ANOVA با استفاده از بسته آماری SigmaStat 3.5 (نرم‌افزارSystat) انجام شد، هر مقدار گزارش‌شده میانگین دو اندازه‌گیری از چهار تکرار بود. روش دانت در مقایسه چندتایی برحسب گروه کنترلی (روغن آرگان خالص) به کار گرفته شد تا مفهوم میانگین‌ها تعیین شود. مفهوم آماری در p < 0.05 در نظر گرفته شد. شکل ۱. ساختارهای مولکولی: (a) کورن، (b) استیگمستادین و (c) فئوفیتین. ۳. نتایج و بحث مشخصات شیمیایی و فیزیکی روغن آرگان خالص، روغن‌های زیتون و آفتابگردان و ترکیبات آن‌ها با روغن آرگان به‌طور خلاصه در جداول ۲،۳،۴،۵ و ۶ آورده شده‌اند. استرهای متیلی اسید چرب، لزجت، چگالی، ضریب شکست، جزء استیگمستادین، جزء هیدروکربنی، استرهای آلکیلی و رنگ‌دانه‌های کلروفیلی به‌عنوان نشانگرهای احتمالی برای تشخیص ناخالصی یا تقلبی بودن روغن آرگان انتخاب شدند. ۳.۱ استرهای متیلی اسید چرب جدول ۲ نتایج تحلیل استرهای متیلی اسید چرب را در آرگان، سایر روغن‌های گیاهی (VOO, OO, HOSO و SO) و ترکیبات آن‌ها با روغن آرگان نشان می‌دهد. ترکیبات اسید چرب در روغن آرگان خالص و سایر روغن‌های گیاهی در تطابق با ترکیبات مشخص‌شده در مقاله بودند (Hilali و همکارانش ۲۰۰۵، Cayuela و همکارانش ۲۰۰۸). اسیدهای چرب اصلی در VAO, HOSO و SO اسیدهای اولئیک و لینولئیک بودند. روغن‌های VAO, HOSO و SO درصد اسیدهای اولئیک و لینولئیک نسبی زیر را داشتند: به ترتیب ۴۵.۲۳ و ۳۵.۵۱%؛ ۷۹.۲۶ و ۱۱.۱۵%؛ ۱۹.۶۸ و ۶۸.۰۲%، درحالی‌که اسید چرب اصلی موجود در VOO و OO اسید اولئیک بود. VOO و OO روغن‌های درصد اسید اولئیک نسبی زیر را داشتند: به ترتیب ۷۳.۶۲ و ۷۶.۴۲%. نتایج جدول ۲ به‌وضوح این واقعیت را نشان می‌دهند که اسیدهای چرب اصلی می‌توانند به‌عنوان نشانگرهایی برای تشخیص ترکیبات روغن آرگان با سایر روغن‌های موردمطالعه به کار روند موقعی که درصد بیش از ۱۰% است (اختلاف قابل‌توجه آماری، α=۰.۰۵). اسید چرب غیر اصلی، پلامیتیک اسید، با درصد کمتر از ۱۲.۶۵ در تمام روغن‌ها بررسی شد، تنها اختلاف قابل‌توجه بین روغن آرگان خالص و ترکیبات روغن آفتابگردان آن در ۱۰% ارائه شد. همان‌طور که در جدول ۲ نشان داده‌شده است، اسیدهای چرب با درصد کمتر نمی‌توانند جهت تشخیص هیچ‌یک از این ترکیبات روغن آرگان استفاده شوند. به دلیل شباهت در ترکیب اسید چرب روغن‌های خوراکی موردمطالعه و روغن آرگان، اسیدهای چرب نمی‌توانند به‌عنوان نشانگر تشخیص تقلبی بودن روغن آرگان در سطوح کمتر از ۱۰% به کار روند. جدول ۲. درصد FAME ها در روغن‌های خالص و ترکیب‌شده میانگین، n = 8؛ اختلاف قابل‌توجه (α=۰.۰۵)؛ C17:0 ≤ ۰,۱ در تمام روغن‌ها و نمونه‌های ترکیب‌شده. VOO: روغن زیتون خالص؛ OO: روغن زیتون؛ HOSO: روغن آفتابگردان با الوئیک بالا؛ SO: روغن آفتابگردان. برای توصیف ترکیبات جدول ۱ را ببینید. ۳.۲ خواص فیزیکی: لزجت، چگالی و ضریب شکست جدول ۳ انتخابی از خواص فیزیکی روغن آرگان خالص، روغن‌های زیتون و آفتابگردان و سایر ترکیبات آن‌ها با روغن آرگان را نشان می‌دهد. میانگینی از ۱۶ نمونه (VOO و OO) برای مطالعه روغن‌های زیتون استفاده شد زیرا محدوده مقادیر این پارامترها نزدیک به یکدیگر هستند به خاطر این‌که این پارامتر مستقیماً در ارتباط با ترکیب تری اکسیلگلیسرول است. لزجت، چگالی و ضریب شکست VAO در ۲۰℃ و ۴۰℃ به ترتیب ۷۰.۴۷ و ۳۱.۳۳ mPa.s، ۰.۹۱۵۵ و ۰.۹۰۱۹ g cm–۳ و ۱.۴۷۰۱ و ۱.۴۶۳۱ بودند. نتایج چگالی و ضریب شکست مطابق با داده‌های مشخص‌شده در مقاله (Belarbi-Benmahdi و همکارانش ۲۰۰۹، Hilali و همکارانش ۲۰۰۵) و قاعده مراکشی (Norme Marocaine 2003) هستند. داده‌های منتشرشده در مورد لزجت روغن آرگان، در ۳۰℃، توسط Yaghmur و همکارانش (۲۰۰۱)، سازگار با برون‌یابی تئوری داده‌های ما در دمای یکسان بودند. به‌علاوه، نتایج در مورد لزجت، چگالی و ضریب شکست روغن‌های به‌کاررفته جهت آماده‌سازی ترکیبات در این مطالعه در تطابق با داده‌های مقاله هستند. در ۲۰℃، نتایج لزجت تنها اختلافاتی بین ترکیبات ۵۰/۵۰ در روغن‌های زیتون و HOSO با روغن آرگان (ترکیبات ۱/۲ و ۳) دارند. هیچ‌کدام از روغن‌های مطالعه شده یا ترکیبات آن‌ها اختلاف قابل‌توجهی در مقادیر چگالی در ۲۰℃ نداشتند. با این اوصاف، در دمای یکسان، ضریب شکست اختلاف قابل‌توجهی تنها برای روغن آفتابگردان و ترکیب آن در ۵۰% با روغن آرگان (ترکیب ۴) نشان داد، زیرا مقادیر ضریب شکست روغن‌های زیتون و HOSO نزدیک به یکدیگر هستند. اگرچه در جدول ۳ اختلاف قابل‌توجهی در مقادیر لزجت روغن‌های VAO, HOSO و زیتون خالص در ۴۰℃ مشاهده می‌شود، در ترکیبات آرگان ۵/۶ و ۷ (۱۰%) هیچ اختلافی وجود ندارد (α=۰.۰۵). لزجت مشخص‌شده در این شرایط جهت تعیین ترکیبات روغن آرگان با روغن‌های موردمطالعه تا بیش از ۱۰% استفاده نمی‌شود. مقدار چگالی روغن‌های آفتابگردان و زیتون در ۴۰℃، اختلاف قابل‌توجهی با روغن آرگان دارد اما هیچ اختلاف قابل‌توجهی با ترکیبات آن‌ها تا بیش از ۱۰% وجود ندارد (ترکیبات ۵/۶ و ۸). در این دما، چگالی به‌عنوان پارامتری جهت تعیین ترکیبات روغن آرگان با روغن‌های موردمطالعه تا بیش از ۱۰% استفاده نمی‌شود. ضریب شکست در روغن آفتابگردان و ترکیب ۱۰% آن با روغن آرگان (ترکیب ۸) در ۴۰℃ و همچنین ۲۰℃ اختلاف قابل‌توجهی نشان نمی‌دهد. جدول ۳. خواص فیزیکی روغن‌های خالص و ترکیب‌شده. میانگین، n = 8؛ اختلاف قابل‌توجه (α=۰.۰۵)؛ C17:0 ≤ ۰,۱ در تمام روغن‌ها و نمونه‌های ترکیب‌شده. VOO: روغن زیتون خالص؛ OO: روغن زیتون؛ HOSO: روغن آفتابگردان با الوئیک بالا؛ SO: روغن آفتابگردان. برای توصیف ترکیبات جدول ۱ را ببینید. ۳.۳ جزء هیدروکربنی جدول ۴ نتایج تحلیل جزء هیدروکربنی روغن آرگان، روغن‌های گیاهی (VOO،OO ،HOSO و SO) و ترکیبات VAO آن‌ها را نشان می‌دهد. مقایسه ترکیب جزء هیدروکربنی بین VAO و سایر روغن‌های گیاهی حاکی از آن است که در روغن‌های آفتابگردان، هیدروکربن‌های اصلی C29, C27 و C31 هستند، بااین‌حال در روغن‌های زیتون، مطابق با داده‌های منتشرشده، C29 و C31 هیدروکربن‌های اصلی هستند (Bortolomeazzi و همکارانش ۲۰۰۱؛ Buenoو همکارانش ۲۰۰۵). شکل ۲ رنگ‌شناس گازی جزء TLC به‌دست‌آمده در استوانه مویین را نشان می‌دهد. نقطه اوج ۱، بر اساس طیف جرمی آن به‌عنوان کورن شناخته شد، یک هیدروکربن دیترپن موجود در روغن‌های آفتابگردان (HOSO و SO) که در روغن‌های زیتون، چه خالص چه غیر خالص، وجود ندارد. بنابراین، موردتوجه‌ترین داده مشاهده‌شده در شکل ۲ این است که روغن آرگان حاوی کورن نیست. با احتساب نتایج موجود در جدول ۴، کورن می‌تواند به‌عنوان نشانگر احتمالی روغن آرگان تقلبی ساخته‌شده با روغن‌های آفتابگردان تا بیش از ۵% در نظر گرفته شود. در تطابق با داده‌های منتشرشده، جدول ۴ مقدار کورن ۲۷.۱۸-۳۰.۵۲ ppm را ارائه داده است و مقدار هیدروکربن مشخص نشده در روغن‌های آفتابگردان HOSO و SO به ترتیب ۵۲.۲۸-۴۴.۸۱ ppm(RT 12.8 min) است. تحلیل واریانس یک‌طرفه C25 هیچ اختلاف قابل‌توجهی (α=۰.۰۵) بین میانگین‌ها نشان نداد. در ترکیبات روغن آرگان ۱۱ و ۷ در ۱۰ و ۵% HOSO، C27 اختلاف قابل‌توجهی با روغن آرگان خالص داشت. به‌علاوه، در ترکیبات روغن آفتابگردان ۱۰%، اختلافات قابل‌توجهی در تحلیل C29 و C31 مشاهده شد و تنها ترکیب SO در ۵% اختلافاتی را در C31 نشان داد. جدول ۴. جزءهای هیدروکربنی در روغن‌های آرگان خالص و ترکیبی. میانگین، n = 8؛ اختلاف قابل‌توجه (α=۰.۰۵)؛ C17:0 ≤ ۰,۱ در تمام روغن‌ها و نمونه‌های ترکیب‌شده. VOO: روغن زیتون خالص؛ OO: روغن زیتون؛ HOSO: روغن آفتابگردان با الوئیک بالا؛ SO: روغن آفتابگردان. برای توصیف ترکیبات جدول ۱ را ببینید. شکل ۲. مثالی از رنگ‌شناس GC در جزء هیدروکربنی ترکیب (a) VAO و (b) SO 3.4 جزء استیگمستادین به‌منظور تشخیص روغن آرگان خالص تقلبی ساخته‌شده با روغن‌های تصفیه‌شده (OO, HOSO و SO)، ما مقدار قابل‌ملاحظه‌ای استیگمستادین، یک هیدروکربن استروئید تشکیل‌شده توسط آب‌زدایی استرول‌ها به‌خصوص β-سیتوسترول، را بررسی نمودیم. شکل ۳ رنگ‌شناسی گازی در روغن آرگان خالص (شکل ۳a) و ترکیب آن با OO (شکل ۳b) را نشان می‌دهد. هیچ مقدار استیگمستادینی برای روغن آرگان خالص مشاهده نشد. جدول ۵ نتایج تحلیل استیگمستادین در VAO، روغن‌های تصفیه‌شده و ترکیبات آن‌ها را نشان می‌دهد. مقدار استیگمستادین در ترکیبات HOSOو SO 5% به ترتیب ۰.۸۲ و ۰.۹۴ mg/kg بود. بنابراین، در مورد روغن زیتون حاوی ۱۸.۳۵ mg kg–۱ استیگمستادین، ترکیبات روغن آرگان (۵%) مقدار استیگمستادین ۰.۸۸ mg/kg را ارائه می‌دهند. تمام ترکیبات روغن تصفیه‌شده-۵% اختلاف قابل‌توجهی در آزمون ANOVA مقدار استیگمستادین نشان می‌دهند. از داده‌های گزارش‌شده در جدول ۵ می‌توان به‌سادگی با تعیین مقدار استیگمستادین در ترکیبات روغن آرگان موردمطالعه، روغن‌های تصفیه‌شده را تا بیش از ۵% مشخص نمود. ما این را در نظر می‌گیریم که کاربرد طیف‌سنجی جرمی در تشخیص استیگمستادین می‌تواند در تعیین وجود روغن‌های خوراکی تصفیه‌شده در سطوح کمتر کاربردی باشد. شکل ۳. مثالی از رنگ‌شناس GC در جزء هیدروکربنی استروئیدی ترکیب (a) VAO و (b) OO تصفیه‌شده.کلستا-۳، ۵-دین، و ۱.استیگمستادین. جدول ۵. مقدار ۳،۵-استیگمستادین در VAO و روغن‌های تصفیه‌شده. میانگین، n = 8؛ اختلاف قابل‌توجه (α=۰.۰۵)؛ C17:0 ≤ ۰,۱ در تمام روغن‌ها و نمونه‌های ترکیب‌شده. VOO: روغن زیتون خالص؛ OO: روغن زیتون؛ HOSO: روغن آفتابگردان با الوئیک بالا؛ SO: روغن آفتابگردان. برای توصیف ترکیبات جدول ۱ را ببینید. ۳.۵ استرهای آلکیلی اسیدهای چرب محافظت بد یا رسیدن بیش‌ازحد زیتون‌ها، مقدار اسید چرب آزاد و رهاسازی اتانول و متانول با تخمیر را افزایش می‌دهد. مقدار استرهای آلکیلی (متیل و اتیل) در روغن زیتون بیش‌ازحد خالص تنظیم‌شده و به قاعده‌ای محدودشده است. هدف از تشخیص استر آلکیلی اسید چرب در روغن آرگان خالص، اجازه تعیین ترکیباتی با روغن‌های زیتون کم کیفیت است. شکل ۴ رنگ‌شناسی استر آلکیلی (a) روغن آرگان خالص و (b) روغن زیتون معمولی را نشان می‌دهد. نقاط اوج مربوط به استرهای متیل و اتیل اسید پالمیتیک موجود در VAO و OO هستند. به‌علاوه، استرهای متیل و اتیل اشباع‌شده (اولئیک اسید) در هر دو روغن وجود دارند (شکل‌های ۴a و b)، درحالی‌که استرهای متیل و اتیل لینوئیک اسید تنها در روغن آرگان خالص وجود دارند (شکل ۴b). استرهای آلکیلی منحنی‌های اسید چرب هم در روغن آرگان و هم در روغن زیتون مشابه هستند چراکه این روش قادر به تشخیص روغن آرگان تقلبی ساخته‌شده با روغن زیتون نیست. ما فرض کردیم که وجود این اجزا در روغن آرگان خالص می‌تواند ناشی از شرایط ذخیره‌سازی نامناسب دانه‌های آرگان باشد. مطالعه این اجزا به‌عنوان پارامتر کیفی احتمالی در روغن آرگان خالص موردتوجه قرار گرفت. شکل ۴. رنگ‌شناس‌های استر آلکیلی (a) VAO و (b) OO . نقاط اوج مربوط به استرهای متیل و اتیل C16:0 و C18 هستند. a = C18:1, b = C18:2. 3.6 رنگ‌دانه‌های کلروفیلی رنگ روغن زیتون خالص به دلیل وجود رنگ‌دانه‌های کلروفیل و کاراتنوئید، ترکیبی از رنگ‌های سبز و زرد است. به‌علاوه، کلروفیل با اعمال دما و محیط اسیدی در فئوفیتین (فئو-a، a’، b و b’) تبدیل می‌شود که به‌سرعت با اعمال شرایط عملیاتی مختلف در پیروفئوفیتین تجزیه می‌شود (Gandul-Rojas و همکارانش ۲۰۰۰). به‌منظور تشخیص ترکیبات احتمالی روغن آرگان با VOO، رنگ‌دانه‌های کلروفیلی تعیین شدند. شکل ۵ رنگ‌شناسی HPLC مرسوم را در عصاره‌های رنگ‌دانه‌ای روغن‌های زیر نشان می‌دهد: آرگان خالص، زیتون خالص و ترکیب ۱. فئو-a عصاره کلروفیلی اصلی موجود در روغن زیتون خالص بود. رنگ‌دانه‌های کلروفیلی به‌دست‌آمده با جداسازی رنگ‌شناسی عصاره‌های رنگ‌دانه‌ای روغن‌های موردمطالعه در جدول ۶ آورده شده‌اند. وجود عصاره‌های کلروفیلی در VOO در تطابق با یافته‌های قبلی است. این اجزا به دلیل عدم وجود آن‌ها در مواد خام خود و همچنین سایر روغن‌های دانه‌ای در روغن آرگان خالص موجود نیستند. تحلیل فئو-a (جدول ۶) مقدار ۰.۶۸ mg/kg را در ترکیبات روغن آرگان خالص در VOO 5% نشان داد. بنابراین، فئوفیتین-a می‌تواند نشانگر احتمالی وجود روغن زیتون خالص در روغن آرگان خالص تا بیش از ۵% باشد. در تطابق با نتایج مشخص‌شده در این مطالعه می‌توان نتیجه‌گیری کرد که استیگمستادین، هیدروکربن کورن و فئوفیتین-a می‌توانند به‌عنوان نشانگرهای احتمالی در ترکیبات روغن آرگان تا بیش از ۵% به کار روند. یافته‌های ما برای بار اول نشان می‌دهد که استیگمستادین می‌تواند نشانگر بالقوه‌ای برای تشخیص وجود روغن خوراکی تصفیه‌شده در روغن آرگان خالص در سطح ۳% باشد، و یک جایگزین برای تشخیص روغن آفتابگردان تعیین هیدروکربن کورن است. به‌منظور تشخیص روغن‌های زیتون خالص، فئوفیتین-a می‌تواند یک نشانگر احتمالی باشد. تکنیک‌های تحلیلی حساس‌تر برای سطح تقلبی بودن کمتر در روغن آرگان خالص پیشنهاد شدند (GC-MS, LC-MS). یافته‌های ارائه‌شده در اینجا ممکن است به کنترل صحت سنجی روغن آرگان خالص، یک محصول باارزش مراکشی، کمک کنند. شکل ۴. رنگ‌شناس HPLC (410 nm) عصاره‌های رنگ‌دانه کلروفیلی (a) VAO و (b) VOO و (c) ترکیب ۱. ۱. فئوفیتین a؛ ۲. فئوفیتین a’؛ ۳. پیروفئوفیتین a و ۴. نقطه اوج شناسایی نشده (RT= 18,97 min) جدول ۶. مقدار رنگ‌دانه‌های کلروفیلی در روغن‌های خالص و ترکیبات. میانگین، n = 8؛ نقطه اوج شناسایی نشده؛ nd= مشخص نشده؛ . aCV = 5%; bCV = 10% VAO: روغن آرگان خالص؛ VOO: روغن زیتون خالص. برای توصیف ترکیبات جدول ۱ را ببینید. تقدیر و تشکر نویسندگان از سازمان اسپانیایی برای همکاری بین‌المللی (AECID-MAE) در حمایت مالی از پروژه A1/038569/11 تقدیر و تشکر می‌کنند.